Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng khuyếch đại chuỗi gen (nhân bản nucleic acid), là một trong những kỹ thuật xét nghiệm phân tử đang được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng trên người, động vật, trong công nghiệp thực phẩm, môi trường.

Ưu điểm:

Phát hiện sớm: Về lý thuyết, chỉ cần một vài mẫu vật liệu di truyền (nuleic acid: NA) (DNA hoặc RNA), cũng có thể phát hiện được, vì sau khi được nhân bản (trong khoảng 1-2 giờ) trong máy khuyếch đại, nó sẽ thành hàng tỷ bản và có thể “đọc” được trên máy (2^20 ≈ 1 triệu; 2^30 ≈ 1 tỷ). Như vậy có thể phát hiện ngay trong giai đoạn mới nhiễm chưa có triệu chứng, khi lượng vi rút trong cơ thể còn ít, khó có thể phát hiện bằng các xét nghiệm khác. Các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán Covid-19 hiện nay đều đạt độ nhạy hơn 95%, tức là khả năng bỏ sót chỉ vài phần trăm. Kết quả còn phụ thuộc: thời điểm lấy mẫu, chất lượng mẫu, thao tác kỹ thuật xét nhiệm, chất lượng test kit.

Đặc hiệu: Không nhầm lẫn giữa các mầm bệnh, vì chỉ chọn nhân bản những đoạn gen đặc trưng riêng cho vi trùng đó. Các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán Covid-19 hiện nay đều đạt độ đặc hiệu gần 100% (không có dương giả)

Nhược điểm: cần những trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, sinh phẩm chất lượng, kỹ thuật phức tạp, nhân viên lành nghề. Chi phí trung bình từ 500K-800K/test tuỳ loại sinh phẩm. Thời gian thực hiện từ 2-4 giờ/test (làm thực tế cần nhiều thời gian hơn)

Các công đoạn thực hiện chính gồm:

1. Phối trộn sinh phẩm: đơn giản, theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2. Tách chiết NA (DNA hoặc RNA): đây là công đoạn phức tạp, quyết định phần lớn sự thành công của phương pháp, đòi hỏi sự tỉ mỉ và làm tốn nhiều công sức của kỹ thuật viên (KTV), mất từ vài chục phút đến hàng giờ cho mỗi test. Công việc gồm phối trộn bệnh phẩm với hoá chất, lắc, ly tâm, hút tách nhằm làm ly giải các vật chất mô, tế bào, protein (trong mẫu bệnh phẩm), làm kết tủa, lọc để chắt được NA sạch. Hình dung, KTV phải làm động tác bấm micropipet để hút nhả dung dịch khoảng vài chục-vài trăm lần/test.

Đây cũng chính là công đoạn làm tăng nguy cơ bị lây nhiễm mầm bệnh cho nhân viên vì khả năng tạo nhiều khí dung mang mầm bệnh. Do đó khi làm xét nghiệm mầm bệnh nguy hiểm (như Covid-19), phải thực hiện tại cơ sở an toàn sinh học cấp 2, trang bị phòng hộ cá nhân cấp 4, thực hành an toàn phòng thí nghiệm cấp 3. Để hỗ trợ, một số hãng có thiết kế những hệ thống tách chiết tự động giúp tăng công suất làm việc cho KTV 2-3 lần, nhưng quan trọng là làm giảm nguy cơ phơi nhiễm cho KTV (nhưng cũng làm tăng chi phí đầu tư).

3.Khuyếch đại: do máy luân nhiệt đảm nhiệm. NA sạch + sinh phẩm đã pha được ủ trong máy luân nhiệt (nhiệt độ ủ trong máy sẽ được tăng giảm theo chu kỳ, ví dụ: 60-72-940C trong khoảng 30-60 giây); sau khoảng 30-40 chu kỳ tăng giảm như vậy, sẽ thu được hàng tỷ bản sao NA. Phát hiện kết quả bằng màu, độ đục, điện di hoặc đậm độ màu phát quang theo thời gian thực (gọi là Real-time PCR)

Hiện cũng đã có một biến thể của kỹ thuật PCR, gọi là kỹ thuật LAMP (khuyếch đại đẳng nhiệt), có thể không cần máy luân nhiệt, chỉ cần một tủ ủ, túi ủ đơn giản; nếu kết hợp với kỹ thuật nhuộm màu thích hợp, kết quả có thể được đọc bằng mắt thường! Nhưng hiện chưa có test Covid-19 theo kỹ thuật này.

Một số biến thể PCR khác:

Digital PCR (PCR kỹ thuật số): là một kỹ thuật PCR mới, trên căn bản tách mẫu chứa NA đích thành hàng ngàn mẫu nhỏ (kích thước nanolite), mỗi mẫu nhỏ này thực hiện khuếch đại chuỗi gen như kiểu PCR. Máy đọc sẽ tính toán số mẫu dương được phát hiện bằng cách đếm số phần mẫu có tín hiệu. (có thiết bị riêng)

ddPCR (Droplet Digital PCR), một dạng biến thể khác của dPCR, việc tách mẫu thành 20.000 phần nhỏ bằng kỹ thuật tạo giọt nhũ tương dầu-nước (có thiết bị riêng)

Chưa sẵn có test Covid-19 theo các kỹ thuật này

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA và ICA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay), cũng được gọi là EIA, là phương pháp thử thực hiện trên các khay đĩa nhựa (gồm nhiều giếng phản ứng), nhằm phát hiện kháng nguyên (KN) hoặc kháng thể (KT) cần tìm trong mẫu nghiệm (máu, huyết thanh, dịch mũi họng) dựa trên cơ sở sử dụng KT gắn enzym và phát hiện bằng phản ứng màu. Thời gian trung bình mỗi thử nghiệm khoảng 2-4 giờ. Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, đang được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm (chẩn đoán viêm gan, HIV, giun sán,….)

ICA (Immunochromatography assay), thường được gọi là test nhanh vì thời gian thực hiện chỉ từ 15 -30 phút. Kỹ thuật này cũng nhằm phát hiện KN, KT. Chất phản ứng được gắn trên các màng thấm. Chỉ cần nhỏ mẫu ở một đầu que thử, sau 10-15 phút phản ứng sẽ được thể hiện bằng các vạch màu nhìn rõ bằng mắt thường.

Hiện đã có nhiều sinh phẩm xét nghiệm Covid-19 theo các kỹ thuật này. Tuy nhiên không được khuyến cáo sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc phát hiện người nhiễm Covid-19 vì:

- Xét nghiệm nhằm phát hiện kháng thể (KT: protein miễn dịch do cơ thể sinh ra để kháng bệnh), nhưng KT chỉ xuất hiện trong máu người bệnh nhiều ngày sau khi nhiễm bệnh. Các xét nghiệm ELISA/ICA Covid-19 hiện nay chỉ phát hiện tốt ở khoảng 14 ngày sau khi khởi bệnh (có triệu chứng). Như vậy không thể phát hiện sớm.

-Ngay cả ở thời điểm phát hiện được thì độ nhạy cũng chỉ đạt 70-80%, như vậy có thể bỏ sót 20-30%

-Độ đặc hiệu cũng không đạt được 100%, tức là có thể dương tính giả

-KT có thể tồn tại lâu trong máu, nên khi xét nghiệm cho kết quả dương tính, cũng không thể khẳng định là người bệnh mới nhiễm hay đã nhiễm lâu và đã khỏi bệnh (không còn mầm bệnh trong người, mặc dù vẫn còn kháng thể).

-Ngay cả các xét nghiệm ELISA/ICA phát hiện kháng nguyên (KN: các thành phần cấu tạo của vi rút) trong dịch mũi hầu cũng chỉ đạt độ nhạy từ 60-80%

Như vậy các xét nghiệm Covid-19 theo kỹ thuật ELISA/ICA chỉ được sử dụng trong một số tình huống dịch tễ nhất định.

                                                                                             Đoàn Văn Hải